La fase oscura de la fotosíntesis

La fase luminosade la fotosíntesis proporciona a las células autótrofas energía química en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH que pueden ser utilizados en otras rutas metabólicas celulares. En el siguiente paso, los organismos autótrofos utilizan esos recursos para asegurarse una provisión de carbono orgánico a partir de una fuente inorgánica de este elemento, el dióxido de carbono presente en la atmósfera o disuelto en el agua.

La asimilación del carbono inorgánico (ese es el nombre preciso del proceso por el cual el carbono inorgánico se incorpora a los compuestos orgánicos) requiere dos procesos químicos diferentes:

1. La unión de la molécula de dióxido de carbono a un compuesto orgánico, que supone la rotura de uno de los enlaces dobles entre el carbono y el oxígeno y la formación en su lugar de un enlace con un compuesto orgánico.
2. La reducción del carbono incorporado a la materia orgánica. En el CO₂ el carbono se encuentra en su máximo estado de oxidación, mientras que toda la materia orgánica se caracteriza porque el carbono está prácticamente siempre más reducido. Hay que tener siempre presente que el entorno que nos rodea es oxidante, por lo que las reducciones suelen ser "químicamente costosas" para los seres vivos. 

Estos dos procesos son independientes de la luz, lo que significa que pueden producirse tanto en su presencia como en su ausencia, siempre que la célula disponga de todos los recursos necesarios: dióxido de carbono, los compuestos orgánicos y las enzimas necesarias para la ruta metabólica, ATP y poder reductor.

La fase oscura de la fotosíntesis tiene lugar íntegramente en el estroma de los cloroplastos.

Fijación del CO₂

El primer paso en la incorporación del carbono inorgánico a la materia orgánica es la fijación del dióxido de carbono. En las plantas verdes este paso puede ocurrir de tres formas distintas, lo que permite distinguir entre tres tipos de fotosíntesis:

• Las plantas C3 producen como primer compuesto orgánico una molécula de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato.
• Las plantas C4 dan lugar en primer lugar a una molécula de oxalacetato que se transforma en malato.
• Las crasuláceas tienen un metabolismo característico (metabolismo ácido de crasuláceas, en inglés CAM) en el que se forma también malato como compuesto orgánico a partir del dióxido de carbono.

 La fotosíntesis más típica es la de las plantas C3, en las que el dióxido de carbono reacciona con la Ribulosa 1,5 difosfato, lo que da lugar a un compuesto de seis carbonos muy inestable que inmediatamente se descompone en dos moléculas de 3-fosfoglicerato. La enzima responsable de este proceso recibe el nombre de Ribulosa Bisfosfato Carboxilasa Oxigenasa (RuBisCO), que es la proteína más abundante en la naturaleza.

La fijación del CO₂ supone un problema fisiológico para la planta. Las hojas son impermeables tanto al paso de líquidos como al de gases, gracias a que están recubiertas por una cutícula de cera. Sin embargo, hay dos procesos fisiológicos que necesitan que se produzca intercambio gaseoso entre la hoja y la atmósfera: la evapotranspiración, imprescindible para el transporte de sustancias disueltas desde las raíces hasta las zonas altas de la planta, y la captación de dióxido de carbono. Para permitir este intercambio las hojas poseen estructuras llamadas estomas, que consisten básicamente en una cámara que se abre al exterior de la hoja a través de una abertura regulable controlada por un par de células. El problema consiste en que cuando se abren los estomas ocurren simultáneamente los dos procesos, el intercambio gaseoso (captación de dióxido de carbono y eliminación de oxígeno) y evapotranspiración, lo que significa que la planta pierde agua para poder realizar la fotosíntesis. Pero en muchos casos conseguir agua resulta difícil para la planta, por lo que la fotosíntesis resulta un proceso costoso.

Por otra parte, la RuBisCO tiene una actividad enzimática doble: además de fijar el dióxido de carbono puede desarrollar una reacción competitiva, la fotorrespiración, en la que interviene la ribulosa difosfato y el oxígeno. Cuando hay luz y la concentración de oxígeno es alta, la fotorrespiración puede reducir en gran medida la eficacia de la fijación.

Hay dos grupos de plantas que han solucionado esos problemas de la fase oscura: las plantas C4 y las crasuláceas. En ambos casos, se ha modificado el paso de fijación del dióxido de carbono, reduciendo la importancia de la fotorrespiración.

Las plantas C4 están particularmente adaptadas a climas cálidos y secos. Estas plantas fijan el dióxido de carbono en las células del mesófilo (las mismas que realizan la fase luminosa) haciéndolo reaccionar con el fosfoenolpiruvato, lo que da lugar a oxalacetato. Este compuesto se transforma luego en malato, que es transportado hasta las células que rodean el haz conductor, más alejadas de la superficie. Allí se descarboxila, y el dióxido de carbono resultante reacciona con la ribulosa 1,5 difosfato, en una reacción catalizada por la RuBisCO. Las células del haz conductor están más protegidas de la luz, y en ellas la concentración de oxígeno es más baja que en el mesófilo, por lo que la fotorrespiración es menos importante.

Las crasuláceas han desarrollado un proceso bastante similar, pero en ellas la separación entre la entrada del CO₂ y su fijación no es espacial, sino temporal: estas plantas, adaptadas a climas muy secos, abren sus estomas durante la noche, para reducir al mínimo posible la evapotranspiración. Sin embargo, en ese momento la célula no cuenta con la energía y el poder reductor necesario para llevar a cabo el ciclo de Calvin, por lo que el dióxido de carbono se fija sobre el fosfoenolpiruvato, dando lugar finalmente a malato, que es almacenado en la vacuola. A partir del amanecer, cuando la planta empieza a desarrollar la fase luminosa con los estomas cerrados, el malato se transforma en oxalacetato, que se descarboxila, y el CO₂resultante es utilizado por la RuBisCO para producir 3 fosfoglicerato. En este caso se consigue también reducir la fotorrespiración, porque se mantiene baja la concentración de oxígeno gracias a que los estomas están cerrados.

Tanto la fotosíntesis C4 como el metabolismo ácido de crasuláceas son costosos para la planta en términos energéticos, pero este inconveniente se compensa sobradamente porque permiten un considerable ahorro de agua, que es el factor limitante del crecimiento de estas plantas en un clima cálido y seco como el que soportan.

El 3-fosfoglicerato formado es un compuesto oxidado, mucho más que las sustancias que habitualmente suele utilizar la célula. La conversión de este compuesto en un monosacárido necesita un aporte de poder reductor y de energía química (ATP) mediante dos reacciones sucesivas: una primera de activación, que da lugar a la formación de 1,3 difosfoglicerato con el gasto de una molécula de ATP, y otra de reducción, que consume NADPH y da lugar a la formación de gliceraldehído 3 fosfato.

El ciclo de Calvin

El gliceraldehído 3 fosfato es un monosacárido (una triosa), y puede ser utilizado como tal por la célula. La formación de esta molécula supone un gasto de ribulosa 1,5 difosfato. Para cerrar por completo el proceso es necesario que la célula recupere, además, este metabolito, lo que supone realizar un conjunto de reacciones químicas denominado ciclo de Calvin, común a todos los organismos autótrofos.

Para que el proceso esté equilibrado en cuanto a cantidad de materia, conseguir una molécula de gliceraldehido 3 fosfato requiere la incorporación de tres moléculas de dióxido de carbono. Esto supone el gasto de otras tres moléculas de ribulosa 1,5 difosfato y da lugar a la formación de seis moléculas de 3-fosfoglicerato y otras tantas de gliceraldehído 3 fosfato.

De esas seis moléculas de gliceraldehído, una es utilizada por la célula como producto neto de la fotosíntesis, mientras que las otras cinco se incorporan al ciclo de Calvin, para dar lugar a tres moléculas de Ribulosa 1,5 difosfato (tantas como se habían consumido) con el gasto de tres moléculas de ATP.

Como resultado final de la fase oscura, la célula incorpora tres moléculas de dióxido de carbono para producir cada molécula de gliceraldehído 3 fosfato, gastando para ello nueve moléculas de ATP y seis de NADPH procedentes de la fase luminosa.

Fotosíntesis I: La fase luminosa

La fotosíntesis es el conjunto de procesos metabólicos mediante los cuales las células fotoautótrofas captan la luz solar y transforman su energía electromagnética en energía química y poder reductor que la célula utiliza en procesos metabólicos, concretamente para transformar dióxido de carbono en moléculas orgánicas.

Desde un punto de vista funcional, en la fotosíntesis se distinguen dos fases o etapas:

• Fase luminosa: recibe este nombre porque necesita la captación de luz por parte de la célula. A su vez, incluye varios subprocesos:
• Captación de la luz por parte de los fotosistemas.
• Transporte electrónico dependiente de la luz
• Fotofosforilación.
• Fase oscura: se llama así porque puede ocurrir independientemente de la presencia de luz; solo necesita que la célula disponga de suficiente cantidad de energía en forma de ATP y de poder reductor en forma de NADPH+H⁺. Incluye, a su vez, varios subprocesos:
• Fijación del dióxido de carbono.
• Reducción del carbono fijado.
• Formación neta de un monosacárido, con recuperación de las moléculas orgánicas utilizadas.

Hablar de "fases" puede inducir a un error bastante común: los dos procesos no tienen por qué ocurrir separadamente, ni mucho menos uno detrás del otro. La relación entre ellos es más bien de dependencia, no de sucesión: las reacciones de la fase oscura necesitan los productos que se obtienen en la fase luminosa. Del mismo modo, el uso del término "fase oscura", por oposición a la fase luminosa, también es equívoco. De hecho, en la mayor parte de las plantas la fase luminosa y la fase oscura de la fotosíntesis ocurren simultáneamente, sobre todo durante el día, por el mero hecho de que la célula tiene dificultades para almacenar ATP y poder reductor. Solo un grupo de plantas especialmente adaptadas a la falta de agua, las crasuláceas, realizan la fase oscura durante la noche, precisamente para reducir la pérdida de agua por evapotranspiración.

La fotosíntesis, en los organismos eucariotas, tiene lugar en el interior de los cloroplastos: la fase luminosa ocurre ligada a la membrana interna, que se continua con la membrana de los tilacoides, mientras que la fase oscura tiene lugar en el estroma del cloroplasto.

Fase luminosa

En esencia, la fase luminosa consiste en una transformación energética: la energía electromagnética de la luz se transforma, en primer lugar, en un flujo de electrones cuyo destino final es una coenzima de oxidación-reducción, el NADPH+H⁺. Por otra parte, una parte de la energía liberada en las transferencias de electrones a lo largo de una cadena transportadora se utiliza para generar un gradiente de protones a través de la membrana interna del cloroplasto. Este gradiente se acopla a la síntesis de ATP gracias a la acción de la ATP sintasa. Como el resultado final de la fase luminosa es la formación de ATP acoplada a la captación de energía luminosa, recibe también el nombre de fotofosforilación.

Los elementos necesarios para llevar a cabo el proceso global de la fase luminosa son, según esto:

1. Un mecanismo que transforme la energía luminosa en un flujo de electrones.
2. Una sustancia que proporcione los electrones que van a moverse a lo largo del proceso.
3. Una cadena de transporte electrónico, que genere el gradiente de protones.
4. Una sustancia que reciba los electrones que se mueven durante el proceso.
5. Un sistema que acople el flujo de protones a favor de gradiente a la síntesis de ATP.

Las cadenas de transporte electrónico que intervienen en el proceso son similares, en su naturaleza, a las que participan en la fosforilación oxidativa. Lo mismo ocurre con la ATP sintasa. La sustancia que, finalmente, proporciona los electrones es el agua, y la que los recibe es el NADPH+H⁺, una coenzima de oxidación reducción bastante parecida al NADH+H⁺. El elemento más novedoso de todo el proceso es, por tanto, el sistema de captación y transformación de la energía luminosa.

1. Captación y transformación de la energía luminosa

La captación de energía luminosa consiste en la absorción de fotones por parte de alguna sustancia. Cuando observamos un objeto, su color corresponde a la luz que refleja, mientras que la radiación de otras longitudes de onda es "absorbida" pos sus moléculas. La energía captada por esa molécula, que recibe el nombre genérico de pigmento, no desaparece, sino que puede dar lugar a diferentes procesos físico-químicos. En la mayoría de los casos, el proceso consiste simplemente en el incremento de la temperatura del objeto, porque la radiación incrementa la agitación de las moléculas, pero son posibles otro tipo de fenómenos distintos, como la emisión de luz de otra longitud de onda (fluorescencia) o la emisión de electrones por parte de la molécula (efecto fotoeléctrico o fotovoltaico).

El efecto fotoeléctrico consiste en que un fotón que incide sobre el átomo de una sustancia capaz de absorberlo transfiere una parte de su energía a un electrón, arrancándolo y dejando al átomo cargado positivamente. Se trata del mismo proceso que ocurre en las células fotovoltaicas, en las que la luz "arranca" electrones que son transportados a lo largo de un sistema conductor, con lo que la energía de su movimiento puede ser utilizada en forma de corriente eléctrica.

En la fase luminosa de la fotosíntesis ocurre exactamente lo mismo: un fotón incide sobre una sustancia capaz de absorberlo (la clorofila u otro pigmento fotosintético), arrancándole un electrón. En este caso, el "sistema conductor" que recoge el electrón es una cadena transportadora, y el uso que se hace de la energía es, como se ha dicho, generar un gradiente de protones.

En las células vegetales, las moléculas capaces de captar la luz y perder electrones como consecuencia de haber absorbido esta energía son los llamados pigmentos fotosintéticos. El más abundante de ellos es la clorofila, la sustancia que proporciona el color verde a la mayoría de los órganos vegetales. Junto a la clorofila aparecen en los orgánulos fotosintéticos otros pigmentos accesorios, como los carotenos, de color rojo, o las xantofilas, amarillas.

La clorofila es una molécula formada por una estructura cíclica llamada porfirina y una cola hidrocarbonada de cadena apolar. El grupo porfirínico es una estructura cíclica en cuyo centro puede atrapar un átomo metálico. Esto es muy importante, porque los metales tienen mucha más facilidad que los no metales para ceder o ganar electrones, lo que les permite participar en reacciones redox.

En el caso de la clorofila, el átomo metálico es de magnesio, pero existen otras sustancias con grupos porfirínicos que tienen unidos otros elementos: hierro en el caso de la hemoglobina, o cobre en el de la hemocianina. La cadena apolar de la clorofila es un alcohol de cadena larga, llamado fitol. Esta parte de la molécula se integra en la membrana, mientras que el grupo porfirínico permanece fuera de ella.

Fotosistemas

La clorofila no se encuentra aislada en la membrana del cloroplasto, sino junto a otros pigmentos y a varias proteínas formando estructuras que reciben el nombre de fotosistemas. El fotosistema es la unidad funcional del proceso de captación y transformación de la energía luminosa. Está compuesto por varias moléculas de clorofila y de otros pigmentos accesorios (carotenos, xantofilas...) y diferentes proteías, dispuestas formando una estructura cilíndrica integrada en la membrana. En el centro de dicha estructura hay una molécula especial de clorofila, llamada "centro reactivo", que es capaz de ceder electrones cuando recibe energía electromagnética.

Los cloroplastos poseen dos tipos distintos de fotosistemas, que se distinguen entre sí tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista de su función, los fotosistemas se diferencian por la parte del espectro electromagnético que son capaces de utilizar: el fotosistema I también recibe el nombre de P700, porque tiene un máximo de absorción en torno a los 700nm, mientras que el fotosistema II (P680) presenta una absorción máxima a longitudes de onda en torno a los 680nm o menores, lo que signifca que necesita radiación de mayor energía. Esta diferencia de comportamiento se debe a que ambos fotosistemas poseen pigmentos ligeramente distintos.

Cuando el fotosistema pierde electrones necesita recuperarlos, tomándolos de una sustancia reducida capaz de proporcionárselos. En las plantas, el fotosistema I puede recibir electrones desde dos donadores distintos: de él mismo, tras un flujo de electrones cíclico en el que los transportadores electrónicos acaban devolviendo el par electrónico al propio fotosistema, o del fotosistema II. En el caso del fotosistema II la sustancia que cede los electrones es el agua, que libera protones produciendo oxígeno en el proceso (fotosíntesis oxigénica).

Las cadenas de transporte electrónico

El cloroplasto posee, en realidad, una unica cadena de transporte electrónico, que se encuentra asociada a los dos tipos de fotosistemas. Los elementos más importantes de dicha cadena son los siguientes:

• La feofitina es una molécula estructuralmente similar a la clorofila, excepto porque carece del átomo de magnesio característico. Está asociada a los fotosistemas, de los que recibe los electrones.
• La plastoquinona es una molécula de pequeño tamaño, soluble en la membrana. Recibe los electrones de la feofitina y los cede al citocromo b₆f.
• El citocromo b₆f es una proteína transmembrana, que parece actuar también como bomba de protones, por lo que sería el responsable de la creación del gradiente de protones para la fosforilación.
• La plastocianina es una proteína pequeña y móvil, que puede ceder los electrones a diferentes compuestos, en función del fotosistema al que esté asociada.
• Si forma parte del fotosistema II cede electrones al fotosistema I
• Si forma parte del fotosistema I, cuando participa en el flujo cíclico de electrones, también los cede al fotosistema I.
• Si forma parte del fotosistema I, pero participando en el flujo no cíclico, cede los electrones al NADP dando lugar a NADPH.

Flujo cíclico y flujo no cíclico

Los dos fotosistemas presentes en el cloroplasto pueden funcionar de modo diferente: si el fotosistema I actúa solo, la cadena de transporte electrónico acaba devolviendo los electrones al mismo fotosistema. A lo largo del proceso se genera un gradiente quimiosmótico de protones, que se acumulan en el espacio intermembranoso. Este gradiente puede ser aprovechado por la ATP sintasa para la producción de ATP.

También puede ocurrir que los dos fotosistemas actúen coordinadamente, en lo que se conoce como "flujo no cíclico de electrones". En este caso, el fotosistema I cede los electrones a la cadena de transporte, pero la plastocianina acaba traspasándolos al NADP, con lo que lo transforma en NADPH que puede utilizarse como fuente de poder reductor. Sin embargo, esto deja al fotosistema I con un déficit electrónico, que debe ser eliminado. Esta es la función del fotosistema II: éste capta luz, excitándose y cediendo los electrones a la cadena transportadora. En este caso, la plastocianina cede los electrones al fotosistema I, dejando a éste de nuevo en condiciones de empezar a funcionar. Este conjunto de transferencias electrónicas se utiliza también para producir ATP mediante una fosforilación quimiosmótica.

El déficit de electrones del fotosistema II se subsana de un modo diferente, ya que este complejo tiene la capacidad de romper moléculas de agua, arrancándoles electrones y traspasándolos a la clorofila que los había perdido. El producto final de la rotura de la molécula de agua es la formación de oxígeno molecular, por lo que el proceso es conocido como fotosíntesis oxigénica.

Perspectiva evolutiva

Desde el punto de vista de la historia evolutiva, los primeros organismos fotosintéticos se desarrollaron en un ambiente anóxico (carente de oxígeno), en el que  no debía resultar difícil conseguir moléculas donadoras de electrones (poder reductor), de modo que resultaba suficiente el funcionamiento del fotosistema I para producir ATP. La aparición de un segundo fotosistema, capaz de utilizar un mayor rango de longitudes de onda, proporcionó a esos organismos una mayor eficacia. El resultado, sin embargo, produjo grandes cambios ambientales a escala planetaria: el nuevo fotosistema utilizaba el agua como donante de electrones, produciendo oxígeno como residuo. La acumulación de este compuesto dio lugar a la revolución del oxígeno: en primer lugar, el caracter químico del entorno cambió para hacerse oxidante. En segundo lugar, el oxígeno se acumuló en la atmósfera hasta alcanzar la concentración actual (una quinta parte de los gases que la forman).

Pero el oxígeno era tóxico para la mayor parte de los organismos, que utilizaban sobre todo compuestos químicos reducidos, susceptibles de reaccionar con este gas. La presencia de oxígeno provocó, indirectamente, la evolución de las grandes rutas metabólicas celulares: la aparición de la respiración celular, que aprovecha el oxígeno para aumentar el rendimiento energético de la degradación de los compuestos orgánicos y la propia fotosíntesis, ya que los organismos necesitaban ahora una fuente de poder reductor, mucho más escasa en un entorno oxidante.

Este cambio químico también fue el responsable del origen de la eucariosis, mediante la simbiosis entre organismos procariotas incapaces de utilizar el oxígeno y otros que sí tenían esta capacidad. Por último, la considerable acumulación de oxígeno terminó por formar la capa de ozono, que incrementó la protección frente a la radiación ultravioleta, reduciendo la frecuencia de mutación que sufrían los organismos. Se considera que esta mayor estabilidad permitió, a su vez, la "radiación del Cámbrico", el mayor fenómeno de aparición de nuevas formas de vida que se ha producido en nuestro planeta.